PCR技术的基本操作和应用 知识点题库

（1） 玉米秸秆中的纤维素经充分水解后的产物可被酵母菌利用发酵生产酒精。培养酵母菌时，该水解产物为酵母菌的生长提供。发酵过程中检测酵母菌数量可采用法或稀释涂布平板法计数。

（2） 玉米淀粉经酶解形成的葡萄糖可在葡萄糖异构酶的作用下转化成果糖。利用技术可使葡萄糖异构酶重复利用，从而降低生产成本。

（3） 利用PCR技术扩增葡萄糖异构酶基因时，需用耐高温的催化。PCR一般要经历三十次以上的循环，每次循环包括变性、和三步。

 

（1） 由于女性自然周期产生的卵子太少，捐献者在取卵前通常需要注射激素，促使一次有更多的卵泡发育．

（2） 过程③中防止多精入卵的屏障有和卵细胞膜反应．判断卵子受精的重要标志是．

（3） 上述“三亲婴儿”技术的好处之一是可避免母亲甲（填“细胞核”或“细胞质”）中的缺陷基因传给下一代．④过程为，⑤过程为技术，对移植前的胚胎采用ARY﹣PCR的方法进行性别鉴定时，宜取囊胚期的细胞．

（4） PCR技术可用于产前基因诊断，若某双链DNA分子扩增过程中消耗引物分子14个，则DNA扩增了次．

（1） 人们已经清楚MAP30蛋白的氨基酸序列，可以用方法获得MAP30蛋白的基因。再利用PCR技术扩增该基因，PCR反应体系的主要成分应该包含：、、、、扩增缓冲液（含Mg²⁺)和水等。

（2） 科学家将MAP30蛋白的基因与某种病毒的DNA构建基因表达载体，导入南瓜细胞中，在这个过程中，需要使用到的酶是。为了避免出现“目的基因自我环化”、“目的基因在运载体上反向连接”的问题，请提出一种解决该问题的思路：。

（3） 可用技术得到愈伤组织大规模生产MAP30蛋白，用技术检测MAP30的基因是否在南瓜果实中成功表达。

（4） 弧菌是克氏原鳌虾养殖中重要的致病菌，大规模爆发会给水产养殖带来巨大的经济损失。科研人员为了研究MAP30蛋白抗弧菌的效果，用含不同浓度MAP30蛋白培养液培养弧菌，绘制弧菌生长曲线如下图：

由图可以得出的结论是。

（1） “中心法则”是基因工程兴起的基础理论之一，克里克提出的“中心法则”阐明的遗传信息的流动方向是(用“→连接)。

（2） 从基因文库中提取的目的基因可通过PCR进行扩增，简要叙述扩增目的基因的大致过程：。在PCR过程中，两个引物是的结合位点，也是子链延伸的起点，dNTP在此过程中的作用是。与基因组文库相比，cDNA文库的基因数相对要少。其原因是。

（3） 将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，通过农杆菌的转化作用，可以使目的基因进入植物细胞并插入到植物细胞染色体的DNA上，这种方法的目的是。将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射法，采用显微注射仪直接将注入到受精卵细胞中。

（1） 利用 PCR 技术可以扩增目的基因，PCR 反应体系中除含缓冲液、模板 DNA，dNTP（包含 dATP、dCTP、 dGTP、dTTP）、引物外，还应含有；引物应选用下图中的（填图中字母）。

（2） 在基因工程操作步骤中，过程①②称为。已知氨苄青霉素不能有效杀死小鼠细胞， 而一定浓度的 G418 能有效杀死不具有 Neo^r 的小鼠细胞。结合上图推测，过程①选用的 2 种限制酶是（填图中的编号），③处的培养液应添加（填“氨苄青霉素”或“G418”）。

（3） 图中桑椹胚需通过技术移入代孕小鼠子宫内继续发育，进行该操作前需对受体小鼠进行处理。

（1） 基因工程中可通过PCR技术扩增目的基因。生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是；在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA分子双链间的。

（2） 已知碱性磷酸酶能除去核苷酸末端的5磷酸，构建表达载体的过程中用该酶处理Ti质粒，但HSA基因不用碱性磷酸酶处理，这样做的目的是，经过上述处理后的Ti质粒在DNA连接酶的作用下可与HSA基因之间形成个磷酸二酯键，再经相关处理获得结构完整的重组DNA分子。

（3） 过程①中需将植物细胞与农杆菌混合后共同培养后，还应转接到含的培养基上筛选出转化的植物细胞。③过程中将目的基因导入绵羊受体细胞，采用最多，也是最为有效的方法是，还可以使用动物病毒作为载体，实现转化。

（4） 为检测HSA基因的表达情况，可提取受体细胞的，用抗血清白蛋白的抗体进行杂交实验。

（1） 为了获得大量的SARS冠状病毒N蛋白目的基因，可以采用PCR技术在体外扩增，该技术还需要dNTP、酶以及引物等，扩增三轮需要的引物数量为个。

（2） 若双链DNA几乎具有等量的净电荷，且在高于等电点的pH溶液中带负电荷。利用琼脂糖凝胶电泳进行分离和纯化DNA分子主要依据不同，采用外加电场使其分开。在电泳槽中还需要加入作为参照物进行鉴定。

（3） 小鼠被抗原蛋白免疫后，可以从中获取细胞Ⅰ。细胞Ⅰ中可能包含多种能产生抗体的细胞，原因是。

（4） 为了分离出只能产生mAb的细胞Ⅱ，需要用技术对杂交瘤细胞进行筛选。目前可将图中的作为疫苗，预防SARS冠状病毒引发的疾病。

（1） 利用 PCR 技术进行新冠病毒核酸检测的前提是。新冠病毒是 RNA 病毒，所以需对样本进行处理后再 PCR 扩增，如果样本存在目标病原体，则会因为的特异性，扩增出相应的目标基因片段，由此判断是否为阳性。

（2） 荧光 PCR法，又称qPCR法，是指在在反应体系中加入，通过专门仪器实现实时荧光检测，以来测定PCR循环后产物中核酸水平。

（3） IgM和IgG均属于免疫球蛋白家族，是机体在抗原物质刺激下由浆细胞产生的抗体。IgM/IgG检测试剂盒的原理是 ，通过检测人体内相应抗体间接证明感染与否。被病毒感染后，机体会产生一系列的变化来抵御这种入侵，其中IgM和 IgG的含量会发生如图所示变化。

通过对 COVID-19患者研究发现，病毒侵入人体后，大约需要5~7天产生 IgM抗体，IgG抗体在感染后10～15 天时产生。通过检测外周血中IgM 和IgG，不仅可以鉴别感染与否，还可以辨别检测者是近期感染或者是既往感染。当核酸检测结果为阳性，IgM（+）IgG （-）时，可判断检测者为；已治愈的患者检测结果应为。

（1） 传统抗体的制备是向生物体内反复注射某种抗原，使生物体产生抗体，从动物的细胞中分离所需抗体，但用这种方法提取的抗体，具有（至少写出两点）等缺点，现在逐步被单克隆抗体取代。

（2） 单克隆抗体具有（至少写出两点）等优点。制备时需要从康复者的脾脏中分离出B淋巴细胞在体外将其与骨髓瘤细胞进行融合，常见的融合方法有电激、聚乙二醇、等，然后再经筛选、培养等步骤大量获得。最终获得的杂交瘤细胞具有的特点是。

（3） 体外培养杂交瘤细胞时，所需CO₂的主要作用是；另外，应定期更换培养液，以便清除细胞代谢产物，防止。

（4） 科学家不断探索寻求制备新冠病毒抗体的方法，某科研小组欲利用基因工程技术制备新冠病毒抗体，其大致流程如下图：

①  新冠病毒抗体基因确定后，可通过PCR技术特异性地快速扩增，PCR技术扩增目的基因的前提条件是。

②人体合成的抗体需要膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性，与大肠杆菌作为受体细胞相比，选择酵母菌作为受体细胞的优势是。

（1） 制备腺病毒载体新冠病毒疫苗时，首先需在的作用下，以新冠病毒的遗传物质RNA为模板经过逆转录得到S抗原基因。接着常利用技术扩增S抗原基因，为了便于S抗原基因与腺病毒载体的连接，需要在引物的5'端加上位点。

（2） S抗原基因整合进腺病毒基因组时，需将S抗原基因插在腺病毒载体的启动子和终止子之间，使S抗原基因能，从而激发人体产生抵抗新冠病毒的抗体和记忆细胞；腺病毒中负责复制的关键基因片段也需被剪切掉，目的是 ， 从而避免危害人体细胞。

（3） 研究人员还可将S蛋白注人动物体内，一段时间后从脾脏中获取浆细胞，与骨髓瘤细胞融合，并利用选择培养基筛选出。接着 经过多次筛选并在体外培养，获得针对S蛋白的。利用该方法制备的产物来治疗新冠肺炎的原理是。

（4） 接种腺病毒载体疫苗的人若在接种前感染过腺病毒，可能会存在“预存免疫”而降低疫苗的免疫效果，其原因是。

（1） 用总RNA提取试剂盒提取样品总RNA，纯化后用酶合成cDNA，作为基因及荧光定量PCR的模板。

（2） 载体构建与转基因拟南芥的获得。先构建含B基因的表达载体。再用法转化拟南芥（一个B基因整合到一条染色体上）。经10 mg·L^–1草胺膦（PPT）筛选得到T₁代阳性植株，再用PPT筛选T₂代种子，则筛选后纯合转基因株系所占比例为。

（3） 为研究不同热激温度对转基因拟南芥抗逆性的影响，取在1/2 MS + 1%蔗糖+ 0.6%的培养基上生长1周左右长出真叶的拟南芥幼苗；处理1：将拟南芥幼苗置于37℃培养1小时，再置于22℃培养3小时，然后于49℃热激1小时；处理2：直接将拟南芥幼苗置于45℃。2种处理结束后，将幼苗置于22℃、相对湿度为50%、光照周期为16小时光照/8小时黑暗的培养室培养。

（1） 结合上述信息推测GR29发挥抗草甘膦作用的途径可能是。

（2） 将GR29导入大豆细胞前，需将其与酶切后的质粒P连接获得。因GR29基因序列两端无所需的限制酶切位点，据图1推测扩增该基因时需向引物1和引物2的（5'端/3'端）加上限制酶的识别序列。

（3） 荧光定量PCR技术可实现对转基因大豆中目的基因的定量检测。在PCR反应体系中，加入的荧光探针与模板DNA（目的基因）的某条链互补结合，当合成的子链延伸至探针处，探针被酶切降解，荧光监测系统就会接收到荧光信号，具体原理如图2所示。

①可通过检测判定待测植物中是否含有模板DNA，且荧光达到某一特定强度所需的循环次数越，模板DNA含量越高。

②通过上述技术定量检测目的基因，需从设计的多对引物和多种探针中选择特异性最好的组合，为此需进行多组实验，每个实验组需向反应体系中加入。（填字母）

a．转基因大豆的DNA模板

b．非转基因大豆DNA模板

c．足量的待测引物

d．定量的待测引物

e．定量的待测荧光探针

f．热稳定DNA聚合酶

g．解旋酶

h．足量的脱氧核苷酸（dNTP）

③预期随时间变化，荧光强度达到一定值后将不再增加，这是由于。

（1） 研究人员采用PCR技术可以获得大量t－PA基因，PCR的原理是。此外，大量获得t－PA基因的方法还有（答出两种）。

（2） 高质量的DNA模板是成功扩增目的基因的前提条件之一，在制备DNA模板时，可以用高温处理的方法去除蛋白质，原因是。

（3） 研究表明，为心梗患者注射大量t－PA会诱发颅内出血，其原因在于t－PA与纤维蛋白结合的特异性不高，若将t－PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血副作用。（注：如图表示相关的目的基因、载体及限制酶。pCLY11为质粒，新霉素为抗生素。）请回答下列问题：

①改造t－PA蛋白你认为应该直接对蛋白质进行改造，还是对天然的t－PA基因进行序列改造，原因是？。

②如图所示，需选用限制酶XmaⅠ和切开质粒pCLY11，才能与t－PA改良基因高效连接。在基因工程的基本操作过程中，最核心的步骤是基因表达载体的构建，其目的是。

③应该选择不含的大肠杆菌作为受体细胞，以便在加入新霉素的选择培养基中筛选出导入质粒的大肠杆菌。筛选出的大肠杆菌菌落并非都是目的菌株，这时选择色的菌落，进一步培养、检测和鉴定，以选育出能生产改良t－PA蛋白的工程菌株。