题目

某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签的质粒，请结合实验流程回答下列问题： （1） 目的基因的扩增 ①提取真菌细胞，经逆转录获得cDNA，进一步获得基因m片段。 ②为了获得融合tag标签的蛋白M，设计引物P2时，不能包含基因m终止密码子的编码序列，否则将导致。 ③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是：先将除TaqDNA聚合酶（Taq酶）以外的各成分混合后，加热到80℃以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增，下列叙述正确的有 A．Taq酶最适催化温度范围为50～60℃ B．与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物 C．两条子链的合成一定都是从5′端向3′端延伸 D．PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性 （2） 重组质粒的构建 ①将Sma I切开的载体A与添加同源序列的m混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以促进，形成A-m结合体。将A-m结合体导入大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及酶等，完成质粒的环化。 ②若正确构建的重组质粒A—m仍能被Sma I切开，则Sma I的酶切位点可能在。 （3） 融合蛋白的表达 ①用含有尿嘧啶的培养基培养URA3基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A-m，然后涂布于无尿嘧啶的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是。 ②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含lag标签，说明，后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。 答案： 【1】RNA【2】蛋白M上不含tag标签【3】BC 【1】黏性末端碱基配对【2】DNA连接【3】基因m的连接处、基因m的内部 【1】受体菌在无尿嘧啶的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有URA3基因可以长成菌落【2】融合基因表达（或融合基因正确解码）

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