基因工程的操作程序（详细）知识点题库

用含除草剂的培养基筛选转基因烟草细胞，检测抗除草剂基因是否成功导入和表达。

某种着色性干皮症的致病原因是由于相关染色体DNA发生损伤后，未能完成如图所示的修复过程．下列相关说法不正确的是（　　）

A . 该病是由于染色体结构变异所致 B . 酶Ⅰ或酶Ⅱ功能异常或缺失都可导致患病 C . 完成过程③至少需要2种酶 D . 该修复过程的场所是在细胞核中

如图表示一项重要生物技术的关键步骤，X是获得外源基因并能够表达的细胞．下列说法不正确的是（　　）

A . X是能合成胰岛素的细菌细胞 B . 质粒通常有多个标记基因和多个限制酶切点 C . 基因与运载体的重组只需要DNA连接酶 D . 该细菌的性状被定向改造

下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，BamHI、HindIII、SmaI指示线所示为三种限制酶的酶切位点。

据图回答：

（1）图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用限制酶，同时酶切载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含的培养基上进行。
（2）能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是（）（填字母代号）

A . 启动子 B . tetR C . 复制原点 D . ampR
（3）过程①可采用的操作方法是（）（填字母代号）

A . 农杆菌转化 B . 大肠杆菌转化 C . 显微注射 D . 细胞融合
（4）为检测人乳铁蛋白是否成功表达，可采用（）（填字母代号）技术。

A . 核酸分子杂交 B . 基因序列分析 C . 抗原—抗体杂交 D . PCR
（5）基因工程的四个基本操作步骤是、、和。

下图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kan^r)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下列叙述正确的是（）

A . 构建重组质粒过程中需要限制性内切酶和DNA连接酶 B . 愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C . 卡那霉素抗性基因(kanr)中有该过程所利用的限制性内切酶的识别位点 D . 抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传

回答下列（1）（2）小题

（1）苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：

Ⅰ.酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K₂HPO₄、MgSO₄、苯酚和水，其中可作为碳源的有。

Ⅱ.下图为连续划线法示意图，在图中（填图中序号）区域更易获得单菌落。

Ⅲ.将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加。以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步，以便于菌落计数与分离。

Ⅳ.采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1 ~5号比色管的苯酚浓度应分别为。

管号	1	2	3	4	5	6
苯酚浓度（mg/ L）						1

如果废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释（填序号：①5 ②10 ③20）倍后，再进行比色。

（2）回答下列关于遗传信息的传递与表达的问题
为了探究基因在高等动物体内不同发育阶段和不同类型的细胞中表达的持异性，通常以绿色荧光蛋白编码基因（GFP）作为目的基因构建转基因动物．

Ⅰ.获得GFP基因的方法一般包括和．

Ⅱ.若使用限制酶PstI（识别序列和切割位点如图2A所示）切开GFP，其产生的末端应该为图1中．

Ⅲ.已知图2B所示质粒经EcoRI和AatII联合酶切后形成1.0kb和3.2kb （1kb=1000对碱基）两种DNA片段，若将0.8kb的单个基因插在质粒的PstI位点处，所形成的重组质粒用EcoRI和AatII联合酶切后，能形成两种DNA片段，其大小应分别为kb和kb．

Ⅳ.将上述重组质粒导入小鼠受精卵雄性原核中的常规方法是．

Ⅴ.经上述受精卵移植发育而成头部发荧光的转基因小鼠中，全身各种组织或细胞均含有的物质是．

①GFP蛋白 ②GFPmRNA ③GFP基因

A．① B．①② C．③ D．①②③

回答下列与基因工程有关的问题：

（1）基因工程技术中，是将目的基因导入植物细胞最常用的方法，基中的Ti质粒上的T—DNA是指。
（2）获得的目的基因可利用PCR技术在体外反应体系中扩增，该过程利用的原理是，需要加入的原料是，DNA解旋利用的是原理。
（3）基因工程中使用的载体，除质粒外，还有和。
（4）该技术可以培育抗病转基因植物，也可用于动物的基因治疗。与之相比，单克隆抗体也用于诊断或携带药物治疗癌症，这是利用了它的优点。

生命科学新技术的应用对生物学发展至关重要。下列技术与应用不匹配的是（　　）

A . PCR技术--扩增蛋白质 B . 显微注射技术--培育转基因动物 C . 细胞融合技术--制备单克隆抗体 D . 细胞核移植技术--培育体细胞克隆动物

三七具有防治癌症、抗衰老、降血压血脂等功能，其主要活性成分皂苷尚不能人工合成。但因其生长周期长、病虫害严重、连作障碍等，市场上供不应求。请回答下列有关问题：

（1）现可通过组织培养技术，并大量培养特定细胞系，来实现皂苷的工业化生产。基本流程为：获取三七外植体——消毒——诱导愈伤组织——细胞培养——提取皂苷。
①获取的外植体首先要通过过程培养出愈伤组织。研究发现三七幼茎、幼嫩花蕾等作为外植体诱导形成愈伤组织的成功率较高，这可能因为。

②将愈伤组织接种到发酵罐中进行细胞培养提取皂苷的过程（填“体现”或“未体现”）细胞全能性。在长期细胞培养中，愈伤组织细胞的器官形成能力会发生不可逆的下降，原因有染色体畸变、细胞核变异或等，因此需要定期培育新的愈伤组织来维持生产的可持续性。
（2）病毒诱导基因沉默（VIGS）是指通过将含有目的基因的重组病毒载体导入到宿主植物中，从而导致与目的基因高度同源的植物内源基因沉默的现象。现有三七中一个序列已知、功能未知的基因M，拟利用VIGS技术研究其功能。
①可通过方法扩增目的基因M，然后将其构建至VIGS载体，侵染三七植株。检测被侵染植株基因M的表达量，选择表达量的植株，观察其与对照组的表型差异。若沉默植株出现果实成熟延迟的现象，推测基因M可能与植物激素的合成有关。

②若要进一步验证基因M的功能，可将其构建至其他表达载体中并在新的植株中过量表达。若其确有前述功能，则新的转基因植株可能出现的表型。

下列过程中，很可能没有发生生物膜融合的是（　　）

A . 植物体细胞杂交 B . 细胞杂交 C . 受精过程 D . 目的基因导入大肠杆菌

将人的基因转到动物中构建的动物模型称为人源化转基因动物模型。人源化转基因动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，并为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。人们利用小鼠胚胎干细胞通过如图所示过程构建了“细胞色素酶”的人源转基因小鼠模型。

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（1）过程①需要分离出小鼠囊胚中的细胞，该细胞在功能上具有的特点是。为了实现过程②和③的不同，我们可以在过程②的培养液中加入。
（2）人源化转基因动物模型构建时，其工程的核心是。为检测细胞色素酶基因在小鼠细胞中是否表达，在分子水平的检测方法是。
（3）过程③中培养的细胞大部分会贴附在培养皿的表面生长，这种现象称为。
（4）科研工作者可以利用PCR技术获得更多细胞色素酶基因，利用PCR技术获取目的基因的前提是有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成。
（5）将转入目的基因的胚胎干细胞诱导形成的胚胎移植到代孕母鼠体内前，要对代孕母鼠用激素进行处理。

回答下列有关基因工程的问题：

（1）基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗的目的。干扰素基因缺失的小鼠不能产生成熟淋巴细胞，科研人员利用胚胎干细胞对干扰素基因缺失的小鼠进行了基因治疗。
Ⅰ.为使干扰素基因在小鼠细胞中高效表达需要把来自cDNA文库的干扰素基因片段正确插入基因表达载体的之间。

Ⅱ.将干扰基因导入胚胎干细胞的常用方法是，采用可以鉴定目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA分子上。再将能正常表达干扰素的细胞转入到小鼠体内，这种基因治疗方法称为。
（2）苦荞是一种有名的经济植物，其含有的黄酮类化合物具有降血糖、降血脂等功效。CHS是合成黄酮类化合物的关键酶。有人把经修饰的CHS基因导苦荞细胞中，培育高产黄酮苦荞品系。

Ⅲ.过程①中将修饰后的CHS基因与Ti质粒连接成重组Ti质粒的酶称为。这种酶主要有两类，一类是从T₄噬菌体中分离得到的，另一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为。

Ⅳ.图中将修饰后的CHS基因导入苦荞体细胞的常用方法为，对过程②操作前，需先用Ca²⁺处理农杆菌，使其成为感受态细胞。

真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题：

（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是基因A有，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列，无法表达出蛋白A。
（2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用作为载体，其原因是。
（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有（答出两点即可）等优点。
（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用法进行检测。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是。

乳酸菌是乳酸的传统生产菌，但耐酸能力较差，影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强，但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因（LDH）导入酿酒酵母，获得能产生乳酸的工程菌株。下图1为乳酸和乙醇发酵途径示意图，图2为构建表达载体时所需的关键条件。

（1）乳酸脱氢酶在转基因酿酒酵母中参与厌氧发酵的场所应为。
（2）获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：
①设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。

为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG，且能通过双酶切以正确方向插入质粒，需设计引物1和2。其中引物1的5′端序列应考虑和。

②将上述PCR产物和质粒重组后，导入大肠杆菌，筛选、鉴定，扩增重组质粒。重组质粒上有，所以能在大肠杆菌中扩增。启动子存在物种特异性，易被本物种的转录系统识别并启动转录，因此重组质粒上的乳酸脱氢酶编码序列（能/不能）在大肠杆菌中高效表达。

③提取重组质粒并转入不能合成尿嘧啶的酿酒酵母菌株，在的固体培养基上筛选出转基因酿酒酵母，并进行鉴定。
（3）以葡萄糖为碳源，利用该转基因酿酒酵母进行厌氧发酵，结果既产生乳酸，也产生乙醇。若想进一步提高其乳酸产量，下列措施中不合理的是___________（单选）。

A . 进一步优化发酵条件 B . 使用乳酸菌LDH基因自身的启动子 C . 敲除酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因 D . 对转基因酿酒酵母进行诱变育种

新冠病毒引起的新冠肺炎等目前仍在全球大流行。我国在全球新冠病毒大流行的预防、疫苗的研发等方面，为全球抗疫发挥了积极重要的贡献。

我国科学家首次揭示了新冠病毒的结构，新型冠状病毒是一种有包膜的线性单股正链RNA病毒，其侵染人体气道细胞的机制如图1所示。结合上述结构，科学家运用基因工程的原理，设计了重组腺病毒载体疫苗，流程图如图2所示。回答下列问题：

（1）新冠病毒表面的刺突蛋白S与人体气道细胞表面的特异性结合后，通过方式入侵宿主细胞。
（2）图2基因工程的操作中获取的目的基因是，获取目的基因的方法是。
（3）前期试验阶段，为了检测该疫苗的有效性，可以从注射疫苗的志愿者捐献的血液中，采用的方法进行检测。
（4） S蛋白是科学家研发不同类型新冠疫苗的重要靶点，原因是。

我国通过自主研发，利用水稻胚乳细胞表达平台及蛋白质纯化平台，获得高效表达的高纯度的重组人乳铁蛋白和重组人溶菌酶。全球首创、备受关注的“稻米造血”技术，明年也有望在光谷量产。血清白蛋白这一治疗烧伤、肝硬化等疾病的“黄金救命药”的量产，将有望极大地缓解血荒。

（1）要构建重组人乳铁蛋白基因、重组人溶菌酶基因表达的载体，需在目的基因的上游和下游分别引入。
（2）在造血稻米的培育过程中，研究人员利用水稻外植体经脱分化形成愈伤组织，愈伤组织是由具有能力的细胞组成。若对水稻使用法导入重组质粒则需要在愈伤组织中加入适量的酚类化合物，目的是：，以促进转化。对于筛选后获得的转基因植株自交，若某植株所结种子中具有重组人血清白蛋白的占，则判断该植株为T-DNA单拷贝插入（只插入了一个目的基因）。
（3）某些重组蛋白的使用不会发生药物引发的免疫排斥反应。方法是通过设法除去该蛋白基因中与抗原决定有关的DNA序列而使该药物不含有。不对相应蛋白质直接进行改造而对其基因进行改造的原因是。

草甘膦是一种非选择性除草剂，杀死杂草的同时也杀死农作物。它与植物体内的PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）结构相似，可与PEP竞争结合EPSP合酶，阻止PEP转化，影响植物细胞正常代谢。我国科学家从草甘膦施用土壤中的微生物体内获取草甘膦抗性基因GR29，并将其导入大豆体细胞中获得抗草甘膦的转基因大豆。

（1）结合上述信息推测GR29发挥抗草甘膦作用的途径可能是。
（2）将GR29导入大豆细胞前，需将其与酶切后的质粒P连接获得。因GR29基因序列两端无所需的限制酶切位点，据图1推测扩增该基因时需向引物1和引物2的（5'端/3'端）加上限制酶的识别序列。
（3）荧光定量PCR技术可实现对转基因大豆中目的基因的定量检测。在PCR反应体系中，加入的荧光探针与模板DNA（目的基因）的某条链互补结合，当合成的子链延伸至探针处，探针被酶切降解，荧光监测系统就会接收到荧光信号，具体原理如图2所示。

①可通过检测判定待测植物中是否含有模板DNA，且荧光达到某一特定强度所需的循环次数越，模板DNA含量越高。

②通过上述技术定量检测目的基因，需从设计的多对引物和多种探针中选择特异性最好的组合，为此需进行多组实验，每个实验组需向反应体系中加入。（填字母）

a．转基因大豆的DNA模板

b．非转基因大豆DNA模板

c．足量的待测引物

d．定量的待测引物

e．定量的待测荧光探针

f．热稳定DNA聚合酶

g．解旋酶

h．足量的脱氧核苷酸（dNTP）

③预期随时间变化，荧光强度达到一定值后将不再增加，这是由于。

金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：

（1）从高表达MT 蛋白的生物组织中提取mRNA，通过获得用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的位点。设计引物时需要避免引物之间形成，而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4） PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但的引物需要设定更高的退火温度。
（5）如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有（填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物）。

回答下列（一）、（二）小题：

（1）
（一）紫杉醇是红豆杉属植物产生的一种复杂的次生代谢产物，是目前最好的天然抗癌药物之一。最初的紫杉醇都是从红豆杉树皮中提取的，无法满足人们的需求。利用植物组织培养获得紫杉醇的过程如图所示：

取自红豆杉树皮的外植体需要使用75%的酒精和消毒处理，才能接种到培养基。用纤维素酶和果胶酶除去愈伤组织的细胞壁获取的过程中，常常在（较高/较低）渗透压的溶液中进行。
（2）植物培养基中最常用的糖类是蔗糖，蔗糖除了作为碳源和能源外，还具有的作用。
（3）外植体经诱导形成愈伤组织，并由愈伤组织培养阶段转入细胞悬浮培养阶段，细胞悬浮培养时振荡的意义是。
（4）如果将外源基因导入红豆杉进行遗传改造，下图表示构建重组DNA的过程示意图，载体质粒PO具有四环素抗性基因（tet^r）和氨苄青霉素抗性基因（amp^r），回答下列问题：

图中酶1和酶3分别是、。获得的重组质粒通常通过法导入愈伤组织。
（5）（二）新型冠状病毒是一种具有很强传染能力的RNA病毒。快速、准确地检测新型冠状病毒对病情的确诊和疫情的防控尤为重要，疫苗及药物的研制等都离不开生物技术与工程的支持。
新冠核酸检测采用实时荧光PCR技术：通过咽拭子采集的样本转移至含病毒保存液的采样管中。病毒RNA需要经过酶作用生产cDNA，才能作为PCR的模板。
（6）效应细胞毒性T细胞能识别被感染细胞表面的。阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，可能产生假阴性的因素有。
a.取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值

b.样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解

c.病毒发生变异
（7）利用技术将骨髓瘤细胞和细胞相互融合形成细胞，此细胞生产的抗新冠病毒的单克隆抗体，不仅可以用于对患者的治疗，还能作为特异探针，利用技术对高风险人群进行检测。

鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：

（1）步骤①中，扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是鸡干扰素基因两端的部分核苷酸序列。科研人员还在两种引物的一端分别加上了和序列，以便于后续的剪切和连接。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是。
A．Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点

B．目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点

C．酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同

D．酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同
（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有。
（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是。
（4）用烟草花叶病毒对获得的转基因烟草和普通烟草进行接种实验，接种后第19天对照组植株进入病情指数（植物受病毒侵染的严重程度）为100的平台期，而转基因植株在第天才进入平台期，但此时的病情指数为79。说明转基因烟草植株对病毒的侵染表现出一定的抗性，但抗性较低，可能的原因有。

基因工程的操作程序（详细） 知识点题库

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